【名稱】

非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒（間接法）使用操作說明書

【作用與用途】

用于檢測豬血清中的非洲豬瘟（ASF）病毒抗體，評估養豬場ASF病毒疫苗免疫狀況及感染豬的血清學輔助診斷。

【檢測原理】

非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒采用間接ELISA法，在酶標板條微孔上預包被基因重組的ASF病毒抗原。在實驗中，加入稀釋后的待檢血清，經過溫育后，若樣品中含有ASF病毒特異性抗體，則與酶標板上的抗原結合；經洗滌后除去未結合的抗體和其他成分后，再加入酶結合物，與酶標板上的抗原抗體復合物發生特異性結合；再經洗滌除去未結合的酶結合物；在微孔板中加入底物液，經酶催化形成藍色產物，加入終止液終止反應后，用酶標儀450 nm波長測定反應孔中的吸光度OD值。

【主要成分與含量】

【需自備的材料】 去離子水、微量移液器、酶標儀（450 nm）、計時器、37 ℃ 溫箱、離心機（4000 rpm）等。

【用法與判定】

1、用法

1.1 試劑配制

洗滌工作液：使用前，濃縮的洗滌液應恢復至室溫（20～25℃），并搖動，使沉淀溶解（最好在37℃恒溫培養箱中加熱5～10 min），然后用蒸餾水作10倍稀釋（例如：75 mL的濃縮洗滌液加上675 mL蒸餾水）混勻，稀釋好的洗滌液2～8℃可存放7日。

1.2 樣本處理

① 取動物全血，待血液凝固后，4000 rpm離心10 min，收集上清。也可以自然凝固析出血清，無溶血。

② 在血清稀釋板中按1:50稀釋待檢血清樣品（245 µL樣本稀釋液中加5 µL待檢血清樣品），充分混勻。

注：陰、陽性對照不用稀釋。

1.3 操作步驟

① 取酶標板（根據樣品多少，可拆開分次使用），將稀釋好的待檢血清取100 µL加至酶標板中。同時設陰、陽性對照各2孔，取陰性、陽性對照各100 µL分別加入反應孔中。輕輕振勻孔中樣品，蓋上蓋板膜，37℃溫箱中避光反應30 min。

② 棄去孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液300 µL，靜置1 min后，棄去洗滌液。洗滌4次后在吸水紙上拍干。

③ 配制酶結合物工作液:按體積比1:100（1份酶結合物濃縮液+99份酶結合物稀釋液）混勻備用。

④ 每孔加酶結合物工作液100 µL，蓋上蓋板膜，37℃溫箱中避光反應30 min。

⑤ 棄去孔中的溶液，洗滌4次，方法同②。

⑥ 將底物A液與底物B液按1:1混合，加入孔中，100 µL/孔，蓋上蓋板膜，37℃溫箱中避光反應15 min。

⑦ 每孔加入終止液50 µL，5 min內測定結果。

2、判定

在酶標儀上讀各孔OD450nm值。

① 試驗成立的條件：

陰性對照平均OD450nm值＜0.20且陽性對照平均OD450nm值≥1.0，試驗結果才有效；否則，應進行重復試驗。

② 計算方法：

③ 陰陽性判斷：

S/P＜0.2時，判為陰性；S/P≥0.2時，判為陽性。

【注意事項】

1、試劑盒使用前各試劑應平衡至室溫。使用后放回2~8℃保存。

2、不同批號的試劑盒組份不得混用，不同試劑使用時應防止交叉污染。

3、底物液和終止液不能暴露于強光或接觸氧化劑。

4、待檢血清數量較多時，應先稀釋完所有待檢血清，再加到抗原包被板上，使反應時間一致。

5、稀釋10×濃縮洗滌液時，如發現有結晶，應加熱使其溶解后再使用。

6、移液時，應盡量準確，防止產生氣泡。

7、應嚴格遵守各操作步驟規定的時間和溫度。

【貯藏與有效期】2～8℃避光保存，有效期為12個月。

【規格】96孔/盒；192孔/盒

【生產企業】

北京中海生物科技有限公司

中海生物技術（棗莊）有限公司

網址：jn1z.com

僅供獸醫診斷使用

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